几丁质酶活性测定的方法，与参比液组成

几丁质酶（chitinase，CHT）活性的测定
参考Boller等（1983）的方法提取酶液并测定酶活。（1）酶液的提取：样品中加入1ml 0.1M的磷酸缓冲液（pH6.4，内含0.1g PVP）冰浴匀浆，4℃、12，000 rpm离心20 min，所得上清即为粗酶液；（2）蛋白含量测定：考马斯亮蓝G-250染色法；（3）N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的制作：N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液与0.1M的四硼酸钾（pH9.2）溶液沸水浴3min，冷却后加入对二甲氨基苯甲醛（DMAB）溶液37℃反应20min，测定反应液的OD585值后绘制标准曲线；（3）酶的活性测定：用浓盐酸和95%的乙醇配制10mg/ml的胶状几丁质溶液。1ml胶状几丁质溶液中加入800μl 0.1M的磷酸缓冲液（pH6.4）和200μl酶液，37℃反应2h后沸水浴3min，10,000 rpm离心10min，100μl上清中加20μL 1M的磷酸缓冲液（pH7.1）和80μl 3%脱盐蜗牛酶溶液（w/v），37℃反应30min，加入100μl 0.1M的四硼酸钾（pH9.2）溶液，沸水浴3min，冷却后加入3ml DMAB溶液，37℃反应20min，测定反应液的OD585值。对照的设置：800μl 0.1M的磷酸缓冲液（pH6.4）和200μl酶液的混合液事先在沸水浴中煮沸10min以灭活CHT，再加入胶状几丁质溶液继续上述反应操作。酶的活性表示为样品每毫克蛋白中1min内由CHT催化反应生成的N-乙酰氨基葡萄糖量。

几丁质酶活性的测定：取待测物，加酶提取缓冲液(0.1 mol/L柠檬酸-0.2 mol/L Na2HPO4缓冲液，pH 4.8)，冰浴匀浆后，离心，上清液为粗酶液。酶活性测定参照Boller等的方法，以每小时生成1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖为1个酶活力单位。

分光光度法